來(lái)自《2351 真菌毒素測(cè)定法-2020版藥典》

本法適用于藥材、飲片及中藥制劑中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、展青霉素、伏馬毒素B1、B2及T-2毒素的測(cè)定。

1、 儀器分析方法：

1-1  HPLC法（液相色譜法），采用柱后衍生法，碘衍生法或光化學(xué)衍生法，測(cè)試黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮共4類

1-2  LC-MS/MS法（液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法），測(cè)試全部種類及多種真菌毒素同時(shí)分析

1-3  ELISA法（酶聯(lián)免疫法），僅測(cè)試黃曲霉毒素類

2、 前處理方法

2-1前處理方法（適用于HPLC法和LC-MS/MS法）

舉例（測(cè)試黃曲霉毒素）：取供試品粉末約15g（過(guò)二號(hào)篩），精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11 000r/min），離心5分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液20ml，通過(guò)免疫親合柱，流速每分鐘3ml，用水20ml洗脫（必要時(shí)可以先用淋洗緩沖液10ml洗脫，再用水10ml洗脫），棄去洗脫液，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

前處理方法中，一是稱樣量多達(dá)15-20g，有些中藥材比較珍貴，成本較高；

二是采用免疫親和法進(jìn)行前處理，操作步驟復(fù)雜，柱子儲(chǔ)運(yùn)使用條件需要保持低溫。

三是每種真菌毒素對(duì)應(yīng)一種免疫親和柱和一種儀器分析條件，測(cè)試多種真菌毒素時(shí)，成本很高，而且效率較低。

一般基于這三種原因，實(shí)驗(yàn)員查找其他的前處理方法。

2-2 前處理方法（適用于ELISA法）

稱取供試品粉末約2.0g至50ml離心管中，加入20ml甲醇，振蕩5分鐘，室溫（20～25℃）下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取2ml上清液至10ml干凈離心管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?/span>，加入2ml去離子水渦動(dòng)30秒，再加入6ml三LV甲烷振蕩2分鐘，室溫下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取下層三LV甲烷液3ml至10ml離心管中，置氮吹儀上于50～60℃水浴濃縮至干，加入1ml正己烷渦旋30秒，再加入2ml磷酸鹽緩沖液渦旋1分鐘，室溫下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取下層液，即得。

前處理方法中，兩次濃縮轉(zhuǎn)溶操作，容易影響結(jié)果平行性，氮吹濃縮的效率相對(duì)低。

2-3前處理方法（適用于展青霉素，LC-MS/MS分析）

供試品溶液的制備  取供試品粉末約4g（過(guò)二號(hào)篩），精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加水20ml和果膠酶（活性大于1500IU/g）75μl，混勻，40℃下放置2小時(shí)，精密加入乙腈60ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11 000r/min），離心10分鐘（離心速度4000r/min），取上清液20ml，加入無(wú)水硫酸鎂-無(wú)水醋酸鈉（4：1）混合粉末3g，充分振搖2分鐘，離心10分鐘（離心速度4000r/min），取上清液8ml，通過(guò)展青霉素固相凈化柱，收集凈化液，混勻，精密量取5ml（相當(dāng)于0.3g樣品），置玻璃試管中，40℃條件下用氮?dú)獯抵两桑?%乙腈溶液（用乙酸調(diào)節(jié)pH值至2）定容至0.5ml，渦旋2分鐘使混勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

前處理方法中加入酶，并且在40℃下放置了2小時(shí)，采用展青霉素專用固相萃取柱做前處理，此方法只做展青霉素，比其他采用免疫親和柱凈化的前處理方法略微簡(jiǎn)化。

2-4 前處理方法（適用于10種真菌毒素，LC-MSMS分析）

測(cè)定藥材、飲片及中藥制劑中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、B2及T-2毒素。

取供試品粉末約5g（過(guò)二號(hào)篩），精密稱定，精密加入70%甲醇溶液50ml，超聲處理30分鐘，離心，精密量取上清液10ml，用水稀釋至20ml，搖勻。精密量取3ml，緩慢通過(guò)已經(jīng)處理好的HLB柱［規(guī)格：3ml(60mg)，依次用甲醇和水各3ml洗脫］，直至有適量空氣通過(guò)，收集洗脫液；隨后用3ml甲醇洗脫，收集洗脫液，合并兩次洗脫液，于40℃氮?dú)饩徛抵两?，?0%乙腈溶液定容至1ml，用微孔濾膜(0.22μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

前處理方法中采用了多功能固相萃取柱，經(jīng)過(guò)活化平衡淋洗洗脫步驟后，上機(jī)到LC-MSMS分析，“方法六適用于樣品中多種真菌毒素的篩查測(cè)定，實(shí)際操作中如果遇到毒素有檢出，但樣品中監(jiān)測(cè)離子對(duì)峰面積比與對(duì)照品的監(jiān)測(cè)離子對(duì)峰面積比不一致時(shí)，建議選用其他監(jiān)測(cè)離子對(duì)重新進(jìn)樣確證或選用其他檢測(cè)方法進(jìn)行判定。"

3、 小結(jié)

3-1 酶聯(lián)免疫法（ELIS法）僅測(cè)試黃曲霉毒素類，其他的真菌毒素不在其中；

3-2 HPLC法測(cè)試4類，每類真菌毒素對(duì)應(yīng)一種前處理方法和儀器分析方法；

3-3 LC-MS/MS法可以單獨(dú)測(cè)試某種真菌毒素，也可以一次進(jìn)樣檢測(cè)多種真菌毒素，分析結(jié)果用于篩查還是定量分析，取決于方法驗(yàn)證的數(shù)據(jù)是否符合定量分析的要求。

3-4 LC-MS/MS法的前處理方法引入了固相萃取法凈化，一次前處理操作、一次進(jìn)針?lè)治?/span>10種真菌毒素，這為提高效率、節(jié)約時(shí)間人力物力成本指明了優(yōu)化方向。

3-5 基于LC-MS/MS法，FaTEx-gen固相萃取柱不用活化平衡、淋洗洗脫，樣品萃取溶液一步通過(guò)SPE柱后，填料保留雜質(zhì)，即得目標(biāo)物上機(jī)分析。

4、 FaTEx-gen多真菌毒素一步法凈化柱操作步驟（10多種真菌毒素）

稱取2g樣品，添加一定體積的酸化乙腈溶液，震蕩30min，離心10分鐘，取一定體積的上清液加入FaTEx-gen，以每秒1滴的速度流出，氮吹轉(zhuǎn)溶后上機(jī)到LC-MS/MS分析。

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